高效液相色譜儀原理及操作步驟

之恒儀器

原理
分離原理：利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離。固定相是填充在色譜柱內(nèi)的多孔顆?；蚧瘜W(xué)鍵合相，流動(dòng)相是攜帶樣品通過(guò)色譜柱的液體。當(dāng)樣品注入流動(dòng)相后，由于不同組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配能力不同，在色譜柱中移動(dòng)的速度也不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。
檢測(cè)原理：分離后的各組分依次通過(guò)檢測(cè)器，檢測(cè)器根據(jù)物質(zhì)的光學(xué)、電學(xué)或其他物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，將組分的濃度信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，記錄下來(lái)得到色譜圖。常用的檢測(cè)器有紫外 - 可見(jiàn)光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器等。

操作步驟
1. 準(zhǔn)備工作
檢查儀器：確保儀器各部件正常，包括泵、檢測(cè)器、進(jìn)樣器等，檢查儀器的電源線、信號(hào)線是否連接良好。
選擇色譜柱：根據(jù)樣品的性質(zhì)和分析目的選擇合適的色譜柱，如反相柱、正相柱、離子交換柱等，并將其正確安裝在儀器上。
配制流動(dòng)相：按照實(shí)驗(yàn)要求配制合適的流動(dòng)相，通常需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾和脫氣處理，以去除其中的雜質(zhì)和氣泡，防止對(duì)色譜柱和儀器造成損害。
準(zhǔn)備樣品：將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，如提取、凈化、濃縮等，使其符合進(jìn)樣要求，并將樣品溶解在合適的溶劑中，配制成一定濃度的樣品溶液。
2. 儀器調(diào)試
開(kāi)啟電源：依次開(kāi)啟高效液相色譜儀的各個(gè)部件電源，如泵、檢測(cè)器、柱溫箱等，等待儀器自檢完成。
平衡色譜柱：用流動(dòng)相沖洗色譜柱，使色譜柱達(dá)到平衡狀態(tài)。平衡時(shí)間一般需要 30 分鐘至數(shù)小時(shí)不等，直到基線穩(wěn)定。
設(shè)置儀器參數(shù)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置泵的流速、檢測(cè)器的波長(zhǎng)、柱溫箱的溫度等參數(shù)。流速通常在 0.5 - 1.5 mL/min 之間，檢測(cè)器波長(zhǎng)根據(jù)樣品的吸收特性進(jìn)行選擇，柱溫一般控制在 25 - 40℃。
3. 進(jìn)樣分析
進(jìn)樣：使用進(jìn)樣器將適量的樣品溶液注入到流動(dòng)相中，進(jìn)樣量一般在幾微升至幾十微升之間。進(jìn)樣方式有手動(dòng)進(jìn)樣和自動(dòng)進(jìn)樣兩種，手動(dòng)進(jìn)樣需要使用微量注射器準(zhǔn)確吸取樣品溶液，然后注入進(jìn)樣口;自動(dòng)進(jìn)樣則可以通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器按照預(yù)設(shè)的程序進(jìn)行進(jìn)樣。
分離檢測(cè)：樣品進(jìn)入色譜柱后，在流動(dòng)相的推動(dòng)下進(jìn)行分離，分離后的各組分依次通過(guò)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)器將檢測(cè)到的信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并傳輸?shù)綌?shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
記錄色譜圖：數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄下檢測(cè)器輸出的電信號(hào)，形成色譜圖。色譜圖中橫坐標(biāo)為保留時(shí)間，縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，每個(gè)峰代表一個(gè)組分，根據(jù)峰的保留時(shí)間和峰面積可以對(duì)樣品中的各組分進(jìn)行定性和定量分析。
4. 結(jié)果處理
定性分析：通過(guò)比較樣品中各組分的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，確定樣品中各組分的種類。
定量分析：根據(jù)色譜峰的面積或峰高，采用外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法或歸一化法等方法計(jì)算樣品中各組分的含量。外標(biāo)法是通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品中組分的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算含量;內(nèi)標(biāo)法是在樣品中加入一定量的內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)樣品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值來(lái)計(jì)算含量;歸一化法是假設(shè)樣品中所有組分都出峰，根據(jù)各組分峰面積占總峰面積的比例來(lái)計(jì)算含量。
5. 儀器清洗與關(guān)機(jī)
清洗色譜柱：分析完成后，用適當(dāng)?shù)娜軇_洗色譜柱，去除殘留的樣品和雜質(zhì)。一般先用流動(dòng)相沖洗一段時(shí)間，然后再用甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑沖洗。沖洗時(shí)間根據(jù)色譜柱的污染程度而定，一般為 30 分鐘至數(shù)小時(shí)。
關(guān)閉儀器：關(guān)閉泵、檢測(cè)器、柱溫箱等部件的電源，關(guān)閉儀器的總電源。如果長(zhǎng)時(shí)間不使用儀器，應(yīng)將色譜柱取下，用保護(hù)柱帽密封好，妥善保存。

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