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PCR可以擴增環(huán)狀質(zhì)粒，但需要注意的是，PCR擴增環(huán)狀質(zhì)粒的過程與擴增線性DNA有所不同，且擴增后的產(chǎn)物需要經(jīng)過進一步處理才能形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。以下是對這一問題的詳細解答： 一、PCR擴增環(huán)狀質(zhì)粒的原理環(huán)狀質(zhì)粒PCR構(gòu)建定點突變序列的基本原理是限制性內(nèi)切酶Dpn I特異性切割雙鏈DNA中甲基化序列Gm6ATC。從大腸桿菌中分離的質(zhì)粒已在體內(nèi)的內(nèi)源性Dam甲基化酶作用下被完全甲基化了，因而對Dpn I的切割敏感，半甲基化的DNA被Dpn I切割的效率較低。相反，用四種通用脫氧核糖核苷酸體外合成的DNA沒有甲基化，因而完全抵抗切割。在定點突變后，能用Dpn I降解剩余的甲基化了的野生型模板，從而富集體外合成的未甲基化DNA。 二、PCR擴增環(huán)狀質(zhì)粒的步驟- 質(zhì)粒DNA變性：將質(zhì)粒DNA溶于水中，加入NaOH和EDTA溶液，在37℃下孵育以變性質(zhì)粒DNA模板。
- DNA沉淀與收集：通過加入NaAc中和反應液，并用預冷的乙醇沉淀DNA。離心收集變性的質(zhì)粒DNA，并清洗沉淀后重新溶于水中。
- PCR擴增：以變性的質(zhì)粒DNA為模板，使用兩條寡苷酸和高保真聚合酶進行PCR擴增。經(jīng)過多輪熱循環(huán)后，全長雙鏈質(zhì)粒DNA以線性形式擴增，產(chǎn)生一種DNA雙鏈上帶缺口的突變質(zhì)粒。
- 瓊脂糖凝膠電泳檢查：擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查靶DNA的擴增情況。
- DNA純化：用苯酚-氯仿抽提擴增產(chǎn)物兩次，乙醇沉淀收集DNA。
- DNA磷酸化：將DNA重新溶于噬菌體T4多核苷酸激酶緩沖液中，加入噬菌體T4多核苷酸激酶和ATP進行磷酸化反應。
- 連接反應：使用噬菌體T4 DNA連接酶將磷酸化的DNA進行連接反應，形成環(huán)狀閉合質(zhì)粒。
- Dpn I消化：加入Dpn I緩沖液和Dpn I限制性內(nèi)切酶，混勻后在37℃下孵育以消化剩余的甲基化模板DNA。
- 轉(zhuǎn)化與篩選：將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，篩選突變體并通過序列分析進行確證。
三、注意事項- 保真度高的酶：對于較大的質(zhì)粒，建議使用保真度高的DNA聚合酶以減少錯誤率。
- 循環(huán)次數(shù)：環(huán)狀質(zhì)粒PCR線性擴增應保持在較少循環(huán)次數(shù)，以滿足條件必須使用相對大量的模板DNA。
- Dpn I酶的消化過程：如果擴增反應正常但突變體產(chǎn)量低，應懷疑Dpn I酶的消化過程，必要時可調(diào)整Dpn I的用量和消化時間。
- 質(zhì)粒的修復與提取：擴增后形成的帶缺口的環(huán)狀質(zhì)粒需要轉(zhuǎn)化到宿主中，由宿主細胞內(nèi)的酶自動修復缺口并形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。之后可以從宿主細胞中提取質(zhì)粒進行進一步的分析和應用。
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發(fā)表于 2025-2-26 09:07:26
